Autoři: Bedřich Friedecký, Josef Kratochvíla
Datum zveřejnění: 30.1.2002
Řídící organizace: IFCC a její "Committee on enzyme calibrators of IFCC" ve spolupráci s IRMM Geel (EU)
Způsob zveřejnění: www.irmm.jrc.be, na home-page IRMM Geel postupovat ve směru:
Dosud normalizované rutinní enzymy (únor 2002): AST, ALT, CK, GGT, LD
Teplota měření: +37°C
Referenční materiály: recertifikované RM z původních referenčních materiálů BCR – EU (tento proces v současnosti teprve probíhá)
Referenční postupy měření: jsou vypracovány ve formě SOP pro jednotlivé výše uvedené enzymy (budou postupně publikovány v průběhu roku 2002 a 2003)
Síť referenčních laboratoří pro certifikaci hodnot RM a edukační programy
Účast výrobců diagnostik (zástupci EDMA a DDV): Beckmann Coulter, Bio Systems, Roche Diagnostics, Asahi Kasei Corporation
Účast referenčních, standardizačních a metrologických institutů: Institut of Clinical Biochemistry University of Bonn, Oak Ridge National Laboratory USA, Laboratory for Standardization Milano, European Commission Joint Research Centre, Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, Centre for Preventive Medicine, Nancy
Referenční metody měření katalytických koncentrací rutinních enzymů IFCC při 37°C vycházejí podle podaného návrhu měření ze SOP, odvozených z dřívějších doporučených metod IFCC pro teplotu měření 30°C. Kalibrace je realizována pomocí kalibračních faktorů.
(Aspartátaminotransferáza)
Princip:
Konverze L-aspartátu a 2-oxoglutarátu účinkem AST na oxalacetát a L-glutamát. Následná detekce oxalacetátu oxidací NADH na NAD za katalýzy enzymem MD, sledovaná a kvantifikovaná měřením absorbance při vlnové délce 339 nm. Pyridoxal-5´- fosfát je použit jako koenzym a Tris (hydroxymethyl)-aminometan jako pufr. Jde o princip metody shodný s rutinními metodami měření, označovanými v programu EHK SEKK jako metody dle ECCLS (metody 1).
| Složení reakční směsi | |
|---|---|
| Tris | 80 mmol.l-1 |
| pH (37°C) | 7,65 ± 0,05 |
| L-aspartát | 240 mmol.l-1 |
| NADH | 0,18 mmol.l-1 |
| Pyridoxal-5´-fosfát | 0,1 mmol.l-1 |
| Malát dehydrogenáza | 10 µkat.l-1 (600 U.l-1) |
| Laktát dehydrogenáza | 15 µkat.l-1 (900 U.l-1) |
| 2-oxoglutarát | 12 mmol.l-1 |
| Objemový podíl séra (plazmy) | 0,0833 (odpovídá poměru vzorek : reakční směs 1 : 12) |
| Podmínky měření | |
|---|---|
| Teplota měření | 37°C ±0,1°C |
| Vlnová délka | 339 nm (±1 nm) |
| Šíře spektrálního pásu (pološířka spektr. pásu) | < 2 nm |
| Délka optické dráhy (tloušťka kyvety) | 10 mm ±0,01 mm |
| Doba inkubace (saturace koenzymem) | 300 s |
| Lag fáze (doba od startu do počátku měření) | 90 s |
| Interval měření | 180 s |
| Počet měřicích bodů | > 6 |
| Postup měření: |
| 2,000 ml reagenčního roztoku |
 vytemperování na 37°C |
| 0,200 ml vzorku |
| důkladné promíchání a inkubace 300 s – vytemperování na teplotu 37°C |
| 0,200 ml startovacího činidla |
| důkladné promíchání, počkat 90 s |
| pak měření absorbance po dobu 180 s |
Startovací činidlo:
144 mmol.l-1 vodného roztoku 2-oxoglutarátu (dvojsodné soli, dihydrátu)
Reagenční blank:
Vzorek biologického materiálu je nahrazen stejným objemem 154 mmol.l-1 NaCl. Hodnota 
nesmí přesáhnout 0,002 . min-1. Slouží ke korekci hodnoty měřeného vzorku.
Blank vzorku:
Startovací činidlo je nahrazeno 154 mmol.l-1 NaCl. Používá se jen ke kontrole vhodnosti kalibrátorů a kontrolních materiálů s tím, že jeho hodnota musí být < 1 % hodnoty naměřené katalytické koncentrace AST ve vzorku.
Horní hranice pracovního rozsahu (vyšší mez stanovitelnosti (UL)):
Způsob ředění při překročení horní hranice:
Vzorek musí být naředěn 154 mmol.l-1 NaCl a analýza opakována.
Výpočet:
(po korekci na reagenční blank) . F = AST ve zvolených jednotkách
(kde faktor F = 1905 je pro výpočet v U.l-1 a F = 31,756 pro výpočet v µkat.l-1;
odvozeno z hodnoty ε 339 (NADH) = 630 m2 . mol-1)
(Alaninaminotransferáza)
Princip:
Konverze L-alaninu a 2-oxoglutarátu účinkem ALT na pyruvát a L-glutamát. Následná detekce pyruvátu oxidací NADH na NAD za katalýzy enzymem LD sledovaná a kvantifikovaná měřením absorbance při vlnové délce 339 nm. Pyridoxal-5´-fosfát je použit jako koenzym a Tris jako pufr.
Princip referenční metody a metod, označovaných v programech EHK SEKK jako metody dle ECCLS je totožný (metody 1).
| Složení reakční směsi | |
|---|---|
| Tris | 100 mmol.l-1 |
| pH (37°C) | 7,15 ±0,05 |
| L-alanin | 500 mmol.l-1 |
| NADH | 0,18 mmol.l-1 |
| Pyridoxal-5´-fosfát | 0,1 mmol.l-1 |
| LD | 28,3 µkat.l-1 (1700U.l-1) |
| 2-oxoglutarát | 15 mmol.l-1 |
| Objemový podíl vzorku | 0,0833 (odpovídá poměru vzorku a reakční směsi 1:12) |
| Podmínky měření | |
|---|---|
| Teplota | 37°C ±0,1°C |
| Vlnová délka | 339 nm (±1 nm) |
| Šíře spektrálního pásu (pološířka spektr.pásu) | < 2 nm |
| Délka optické dráhy (tloušťka kyvety) | 10 mm ±0,01 mm |
| Doba inkubace (saturace koenzymem) | 300 s |
| Lag fáze (doba od startu do počátku měření) | 90 s |
| Interval měření | 180 s |
| Počet měřicích bodů | > 6 |
| Postup měření: |
| 2,000 ml reagenčního roztoku |
| vytemperování na 37°C |
| 0,200 ml vzorku |
| důkladné promíchání a inkubace 300 s – vytemperování na teplotu 37°C |
| 0,200 ml startovacího činidla |
| důkladné promíchání, počkat 90 s |
| pak měření absorbance po dobu 180 s |
Startovací činidlo:
180 mmol.l-1 vodného roztoku 2-oxoglutarátu (dvojsodné soli, dihydrátu)
Reagenční blank:
Vzorek biologického materiálu je nahrazen stejným objemem 154 mmol.l-1 NaCl. Hodnota nesmí přesáhnout 0,002 . min-1. Slouží ke korekci hodnoty měřeného vzorku.
Blank vzorku:
Startovací činidlo je nahrazeno 154 mmol.l-1 NaCl. Používá se jen ke kontrole vhodnosti kalibrátorů a kontrolních materiálů s tím, že jeho hodnota musí být <1% hodnoty naměřené katalytické koncentrace ALT ve vzorku.
Horní hranice pracovního rozsahu (vyšší mez stanovitelnosti (UL)) :
Způsob ředění při překročení horní hranice:
Vzorek musí být naředěn 154 mmol.l-1 NaCl a analýza opakována.
Výpočet:
(po korekci na reagenční blank) . F = ALT ve zvolených jednotkách
(kde faktor F = 1905 je pro výpočet v U.l-1 a F = 31,756 pro výpočet v µkat.l-1;
odvozeno z hodnoty ε 339 (NADH) = 630 m2 . mol-1)
(γ-glutamyltransferáza)
Princip:
Enzym GGT katalyzuje reakci glycylglycinu s L-γ-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilidem za vzniku 5-amino-2-nitrobenzoátu a L-γ-glutamyl-γ-glutamyl -3-karboxy-4-nitroanilidu. Vzniklý produkt je intenzivně žlutě zbarvený a jeho množství se stanovuje fotometricky bez potřeby další pomocné chemické reakce. První substrát glycylglycin má současně i funkci pufru. Princip IFCC metody je shodný s principem prakticky všech běžných rutinních metod. Substrát je dobře rozpustný ve vodě (EHK SEKK metody 1).
| Složení reakční směsi | |
|---|---|
| Glycylglycin | 150 mmol.l-1 |
| pH (37°C) | 7,7 ± 0,05 |
| L-γ-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilid | 6 mmol.l-1 |
| Objemový poměr vzorku | 0,0909 (odpovídá poměru vzorku a reakční směsi 1:11) |
| Podmínky měření | |
|---|---|
| Teplota | 37°C ±0,1°C |
| Vlnová délka | 410 nm (±1 nm) |
| Šíře spektrálního pásu (pološířka spektr.pásu) | < 2 nm |
| Délka optické dráhy (tloušťka kyvety) | 10 mm ±0,01 mm |
| Doba inkubace | 180 s |
| Lag fáze (doba od startu do počátku měření) | 60 s |
| Interval měření | 180 s |
| Počet měřicích bodů | > 6 |
| Postup měření: |
| 2,000 ml reagenčního roztoku |
| vytemperování na 37°C |
| 0,250 ml vzorku |
| důkladné promíchání a inkubace 180 s – vytemperování na teplotu 37°C |
| 0,500 ml startovacího činidla |
| důkladné promíchání, počkat 90 s |
| pak měření absorbance po dobu 180 s |
Startovací činidlo:
33,0 mmol.l-1 vodného roztoku L-γ-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilidu (amonné soli, monohydrátu).
Reagenční blank:
Vzorek biologického materiálu je nahrazen stejným objemem 154 mmol.l-1 NaCl. Hodnota nesmí přesáhnout 0,002 . min-1. Slouží ke korekci hodnoty měřeného vzorku.
Blank vzorku:
Startovací činidlo je nahrazeno 154 mmol.l-1 NaCl. Používá se jen ke kontrole vhodnosti kalibrátorů a kontrolních materiálů s tím, že jeho hodnota musí být < 1 % hodnoty naměřené katalytické koncentrace GGT ve vzorku.
Horní hranice pracovního rozsahu (vyšší mez stanovitelnosti (UL)):
Způsob ředění při překročení horní hranice:
Vzorek musí být naředěn 154 mmol.l-1 NaCl a analýza opakována.
Výpočet:
(po korekci na reagenční blank) . F = GGT ve zvolených jednotkách
(kde faktor F = 1382 je pro výpočet v U.l-1 a F = 22,538 pro výpočet v µkat.l-1;
odvozeno z hodnoty ε 410 = 796 m2 . mol-1 pro 5-amino-2-nitrobenzoát)
(Kreatin-N-fosfotransferáza)
Princip:
Enzym kreatinkináza (ATP-Kreatin N-fosfotransferáza) katalyzuje konverzi kreatinfosfátu a ADP na kreatin a ATP. Vzniklý ATP reaguje s glukózou za katalýzy hexokinázy na ADP a glukóza-6-fosfát. Katalytická koncentrace CK je pak vyhodnocena detekční reakcí glukóza-6-fosfátu s NADP za katalýzy glukóza-6-fosfát dehydrogenázy na NADPH. Rychlost redukce NADP na NADPH je funkcí katalytické koncentrace CK. Imidazol slouží jako pufr reakční směsi, kationy hořčíku a N- acetylcystein jako aktivátory reakce, AMP jako složka, blokující interferenci myokinázy. Princip IFCC metody je shodný s principem, používaným u rutinních metod měření a označovaným v EHK – SEKK jako metody dle ECCLS (metody 1).
| Složení reakční směsi | |
|---|---|
| Imidazol | 100 mmol.l-1 |
| pH (37°C) | 6,5 ± 0,05 |
| Kreatin fosfát | 30 mmol.l-1 |
| ADP | 2 mmol.l-1 |
| EDTA | 2 mmol.l-1 |
| Octan hořečnatý | 10 mmol.l-1 |
| N-acetyl-L-cystein | 20 mmol.l-1 |
| AMP | 5 mmol.l-1 |
| P1,P5-di (adenosin-5´) pentafosfát | 0,01 mmol.l-1 |
| D-glukóza | 20 mmol.l-1 |
| NADP | 2 mmol.l-1 |
| Hexokináza | 66,7 µkat.l-1 (4000 U.l-1) |
| Glukóza-6-fosfát dehydrogenáza | 46,7 µkat.l-1 (2800 U.l-1) |
| Objemový podíl vzorku | 0,0435 (odpovídá poměru vzorku a reakční směsi 1:23) |
| Podmínky měření | |
|---|---|
| Teplota | 37°C ±0,1°C |
| Vlnová délka | 339 nm (±1 nm) |
| Šíře spektrálního pásu (pološířka spektr.pásu) | < 2 nm |
| Délka optické dráhy (tloušťka kyvety) | 10 mm ±0,01 mm |
| Doba inkubace | 180 s |
| Lag fáze (doba od startu do počátku měření) | 120 s |
| Interval měření | 120 s |
| Počet měřicích bodů | > 6 |
| Postup měření: |
| 2,000 ml reagenčního roztoku |
| vytemperování na 37°C |
| 0,100 ml vzorku |
| důkladné promíchání a inkubace 180 s – vytemperování na teplotu 37°C |
| 0,200 ml startovacího činidla |
| důkladné promíchání, počkat 20 s |
| pak měření absorbance po dobu 120 s |
Startovací činidlo:
345,0 mmol.l-1 vodného roztoku kreatinfosfátu (dvojsodné soli, tetrahydrátu).
Reagenční blank:
Vzorek biologického materiálu je nahrazen stejným objemem 154 mmol.l-1 NaCl. Hodnota nesmí přesáhnout 0,001 . min-1. Slouží ke korekci hodnoty měřeného vzorku.
Blank vzorku:
Startovací činidlo je nahrazeno 154 mmol.l-1 NaCl. Používá se jen ke kontrole vhodnosti kalibrátorů a kontrolních materiálů s tím, že jeho maximální přípustná hodnota musí být <1% hodnoty naměřené katalytické koncentrace CK ve vzorku.
Horní hranice pracovního rozsahu (vyšší mez stanovitelnosti (UL)):
Způsob ředění při překročení horní hranice:
Vzorek musí být naředěn 154 mmol.l-1 NaCl a analýza opakována.
Výpočet:
(po korekci na reagenční blank) . F = CK ve zvolených jednotkách
(kde faktor F = 3651 je pro výpočet v U.l-1 a F = 60,862 pro výpočet v µkat.l-1;
odvozeno z hodnoty ε 339 (NADPH) = 630 m2 . mol-1)
(Laktátdehydrogenáza)
Princip:
L-laktát je konvertován enzymem LD na pyruvát za současné redukce NAD na NADH. Jako pufru se používá N-methyl-D-glukaminu - MEG).
Pozor! Princip není shodný s doposud nejčastěji používanou metodou stanovení LD, která sleduje opačný reakční průběh a která je v číselníku programu EHK-SEKK uvedena jako metoda 1).
| Složení reakční směsi | |
|---|---|
| N-metyl-D-glukamin | 325 mmol.l-1 |
| pH (37°C) | 9,4 ± 0,05 |
| L-(+)-laktát | 50 mmol.l-1 |
| β-NAD+ | |
| β-NAD+ (volná kyselina) | 3,15 mmol.l-1 |
| β-NAD+ (lithná sůl) | 6,85 mmol.l-1 |
| Objemový poměr vzorku | 0,0435 (odpovídá poměru vzorku : reakční směsi 1 : 23) |
| Podmínky měření | |
|---|---|
| Teplota | 37°C ±0,1°C |
| Vlnová délka | 339 nm (±1 nm) |
| Šíře spektrálního pásu (pološířka spektr.pásu) | < 2 nm |
| Délka optické dráhy (tloušťka kyvety) | 10 mm ±0,01 mm |
| Doba inkubace | 180 s |
| Lag fáze (doba od startu do počátku měření) | 90 s |
| Interval měření | 180 s |
| Počet měřicích bodů | > 6 |
| Postup měření: |
| 2,000 ml reagenčního roztoku |
| vytemperování na 37°C |
| 0,100 ml vzorku |
| důkladné promíchání a inkubace 180 s – vytemperování na teplotu 37°C |
| 0,200 ml startovacího činidla |
| důkladné promíchání, počkat 90 s |
| pak měření absorbance po dobu 180 s |
Startovací činidlo:
Vodný roztok směsi 36,23 mmol.l-1 volné kyseliny NAD a 78,78 mmol.l-1 lithné soli NAD (dihydrátu).
Reagenční blank:
Vzorek biologického materiálu je nahrazen stejným objemem 154 mmol.l-1 NaCl.
Blank vzorku:
Se zpravidla neprovádí. Nutné jen při vysokých koncentracích L-laktátu.
Horní hranice pracovního rozsahu (vyšší mez stanovitelnosti (UL)) :
Způsob ředění při překročení horní hranice:
Vzorek musí být naředěn 154 mmol.l-1 NaCl a analýza opakována.
Výpočet:
(po korekci na reagenční blank) . F = LD ve zvolených jednotkách
(kde faktor F = 3651 je pro výpočet v U.l-1 a F = 60,862 pro výpočet v µkat.l-1;
odvozeno z hodnoty ε 339 (NADPH) = 630 m2 . mol-1)
Vztah k číselníku metod a horní hranici referenčních intervalů - příslušná data jsou uvedena v tabulce 1.
| Enzym | Zařazení odpovídající metody v číselníku metod SEKK(číslo metody dle číselníku) | Horní mez referenčního intervalu v µkat.l-1 | |
|---|---|---|---|
| Ženy | Muži | ||
| AST | 1 | 0,55 | 0,58 |
| ALT | 1 | 0,58 | 0,75 |
| GGT | 1 | 0,63 | 0,92 |
| CK | 1 | 2,4 | 2,8 |
| LD | 3 | 4,2 | |
| α-AMS (substrát G3) |
5 | 1,5 | |
| α-AMS (substrát G7) |
7 | 1,7 | |